基本信息

項目名稱:
As(III)氧化菌篩選、鑒定與氧化機理分析
小類:
生命科學
簡介:
砷導致農田環境污染,危害人類健康。如何有效降低土壤中砷的危害,成為熱點問題之一。本研究通過高濃度砷定向誘導,篩選高砷環境下可生存的優勢菌株,經富集培養及解砷效能驗證,尋找能有效降低砷毒害的微生物,從而獲得一株具較強砷氧化能力菌株,并證明其能夠有效減輕水稻受砷毒害,同時運用差異蛋白組學技術對該菌株的氧化As(III)機理進行了初步探討。
詳細介紹:
采用定向誘導技術,從高砷污染的稻田土壤中篩選、純化、培養砷氧化菌并對其砷氧化能力進行了評價,獲得了一株可將高毒性As(III)氧化為低毒性As(V)的高效菌株;研究了該菌株的最適培養條件,對菌株的形態特征進行了觀察,采用16S rDNA和T-RFLP技術對該菌株進行了分子鑒定。在水培條件下對該菌株減輕水稻受砷毒害的能力進行了驗證;進一步采用蛋白質組學技術初步探討了該菌株在氧化砷過程中細菌胞內、胞外蛋白質差異表達。結果總結如下: 通過篩選,獲得一株能將高毒性As(III)氧化為低毒性As(V)的菌株并命名為CRS003;該菌株的最優培養條件為:以4-羥基苯甲酸為碳源,以蛋白胨為氮源,pH值8,溫度25℃時,搖床轉速128 rpm。在上述培養條件下,該菌株在24h內可將培養液中95%的As(III)轉化為As(V)和少量的甲基砷(MMA)。菌株CRS003為革蘭氏陰性菌(弱陽性),桿菌,無鞭毛;菌株CRS003的分子鑒定結果顯示,其序列同源性與Brevibacillus sp.達到100%。菌株CRS003的T-RFLP片段的數據庫比對結果表明,該菌株為Brevibacillus laterosporus。 在含As(III)的水培溶液中種植水稻(明恢63、雜交稻汕優63、特優航II),驗證結果表明,菌株CRS003有效減輕了As(III)對水稻秧苗的生長的影響。與對照(無As(III)無菌株菌液之培養液)相比,未添加菌株CRS003的菌液時,As(III)對三種水稻根長的抑制率分別為50.37%、56.39%、54.61%,對株高的抑制率分別為43.31%、43.97%、41.07%。而當添加了菌株CRS003的菌液后,As(III)對三種水稻秧苗根長的抑制率分別降低到22.57%、11.47%、18.20%,株高的抑制率分別降低到21.91%、11.39%、17.83%。 在氧化砷的過程中,該菌株的胞內、胞外蛋白質差異表達結果表明,胞外則檢測出6個蛋白點發生上調表達,胞內檢測出33個蛋白點發生上調表達,表明菌株以胞內蛋白質變化為主來實現對As(III)的氧化作用。蛋白質質譜鑒定結果表明,5個胞外蛋白質和27個胞內蛋白質獲得功能鑒定,對32個相應蛋白質進行結構活性位點分析及功能查詢后,胞外蛋白質涉及離子轉運及信號激發等相關功能,而胞內蛋白質則涉及能量代謝及砷解毒等功能。因此通過對查詢到的蛋白質進行圖譜構建,提出了As(III)在該菌株胞內胞外的傳輸過程與解毒機理。

作品圖片

  • As(III)氧化菌篩選、鑒定與氧化機理分析
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作品專業信息

撰寫目的和基本思路

砷對作物和人類健康具有毒害作用。如何有效降低土壤中砷的危害,成為各國政府和科研人員高度關注的問題之一。微生物降解重金屬污染是生物修復的方法之一。該項目從稻田土壤中篩選出了一株砷氧化菌,分析了其砷氧化能力,獲得了最適培養條件,觀察了形態特征,進行了分子鑒定,并驗證了其解砷毒害的能力,探討了該菌株在氧化砷過程中,細菌胞內、胞外蛋白質差異表達,提出了該菌株氧化As(III)機理的假設。

科學性、先進性及獨特之處

將高毒性As(III)氧化為As(V)及甲基砷,是降低砷對作物和人類毒害的有效方法。通過高濃度砷定向誘導,篩選高砷環境下可生存的優勢菌株,經富集培養及解砷效能驗證,尋找能有效降低砷毒害的微生物。研究思路清晰,技術方法合理。獲得一株具較強砷氧化能力菌株側胞短芽孢桿菌,并證明其能夠有效減輕水稻受砷毒害,運用差異蛋白組學技術對該菌株的氧化As(III)機理進行了初步探討。項目方案科學性強。

應用價值和現實意義

砷導致農田環境污染,經食物鏈傳遞到動物和人體,危害人類健康,因此如何有效降低土壤中砷的危害,成為各國政府和科研人員高度關注的問題之一。 微生物降解重金屬污染是生物修復的方法之一,微生物修復技術直接在污染環境中開展生物修復,簡便易行。該項目針對我國砷污染問題,通過篩選高氧化能力微生物菌株,切斷砷從土壤到作物的傳遞鏈,有效降低砷對作物及人類危害。項目選題具重要科學意義及應用價值。

學術論文摘要

采用定向誘導技術,從高砷污染的稻田土中篩選、純化及培養砷氧化菌并對其砷氧化能力進行了評價,獲得了一株可將高毒性的As(III)氧化為低毒性的As(V)的高效菌株,并命名為CRS003。隨后研究了該菌株的最適培養條件,即當以4-羥基苯甲酸為碳源,蛋白胨為氮源,pH值8,溫度25℃,搖床轉速128rpm時,該菌株在24h內可將培養液中95%的As(III)轉化為As(V)和少量的甲基砷(MMA)。觀察菌株的形態特征,該菌株為革蘭氏陰性菌(弱陽性),呈桿狀,桿菌,無鞭毛。進行分子鑒定后,其序列同源性與Brevibacillus sp.達100%,為Brevibacillus laterosporus。在含As(III)的水培溶液中種植水稻,驗證結果表明,菌株CRS003能有效減輕As(III)對水稻秧苗的生長影響。 進一步運用蛋白質組學技術探討了該菌株在氧化As(III)過程中胞內、外蛋白質的差異表達。經蛋白質質譜功能鑒定、結構活性位點分析及功能查詢后,胞外蛋白質涉及離子轉運和信號激發等相關功能,而胞內蛋白質則涉及能量代謝和砷解毒等功能。通過構建已查詢蛋白質的圖譜,推斷了As(III)在該菌株胞內外的傳輸與解毒過程。

獲獎情況

鑒定結果

參考文獻

參考技術: 1、末端限制性長度多肽性分析(T-RFLP);2、毛細管電泳 - 電感耦合等離子體譜聯用儀(CE-ICP-MS);3、雙向電泳(2-DE) 參考文獻: [1]陳德富, 陳喜文. 現代分子生物學實驗原理與技術. 北京:科學出版社. 2006:96-98. [2]GuiDi Yang, JinHua Xu, JinPing Zheng, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta. 2009,78:471-476. [3]陸錦池, 王海斌, 陳榮山, 等. 化感水稻PI312777響應低磷脅迫的差異蛋白質組學分析. 中國農學通報. 2009,25(14):148-152. [4]Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Analytial Chemistry. 1996,68(5):850-858.

同類課題研究水平概述

近年來,隨著煤礦能源的大量無序開采,廢水、廢渣的大量排放,加上含重金屬農藥、除草劑以及化肥等化學產品的大量施用,重金屬污染已成為了一個世界性環境問題。因此,有效治理土壤砷污染已經成為各國政府及研究人員日益重視的問題。2011年3月,國務院已批準《湘江流域重金屬污染治理實施方案》,未來治污資金總額將達595億元,可見重金屬污染治理問題已經勢在必行。 砷雖不屬于重金屬,但行為、來源以及危害都與重金屬相似,故通常列入重金屬類進行討論。首例As(III)氧化細菌于1918年由Green H報道。隨著研究的不斷進展,越來越多As(III)氧化菌被發現,研究較多的典型菌株包括:Alcaligenes faecalis NCIB 8687、Rhizobium sp.NT-26、Agrobacterium tumefaciens 5A、Herminiimonas arsenicoxydans ULPAsl、Thiomonas sp.3As,這些菌株都能夠將毒性強的As(III)氧化為毒性弱的As(V)。 在生物體內砷代謝包括兩個主要過程:(1)As(V)的還原過程;(2)無機砷的甲基化過程。微生物對環境中砷的氧化還原轉化及甲基化和去甲基化等起主導作用, 微生物砷代謝在砷的動態循環起重要作用。國內已發現了一株細菌C13能在有氧條件下將As(III)氧化為As(V),并鑒定了該菌株為土壤桿菌,同時發現兩株細菌C8、C14,能將As(V)還原為As(III),被鑒定為節桿菌、貪銅菌。“ars”砷離子泵作為研究比較透徹的一條解毒路徑,含有該離子泵的微生物可將As(V)還原成As(III),并在ATP酶、As(III)運輸酶作用下把As(III)排出胞外,進而達到降解As(III)毒害的目的。 盡管砷氧化菌株篩選已取得重大進展,然而大部分僅限于氧化能力評價,特別是當前篩選的砷氧化菌在氧化能力評價上受限于儀器分析的靈敏度,一般只是對氧化As(III)、As(V)含量分析,并未涉及甲基化,更重要的是其氧化機理的揭示并沒有明確的結論。因此,本研究從解As(III)毒的細菌篩選,并對解毒能力做了初步驗證,具有較好的應用價值,而且As(III)與菌株蛋白的相互作用結果,為解析重金屬離子與蛋白相互作用,進而分析As(III)轉化與解毒機理,具有重大的實際意義。
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